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          皓奇星 | 細胞培養工藝優化之培養基篇
          2019-12-01

          原創作者:小欣


          摘要:

          繼皓奇星高表達株細胞是怎么煉成的公眾號發布之后,相信不少讀者對如何構建細胞株有了一定的了解,一個優秀的細胞株能讓培養工藝開發工作達到事半功倍的效果,為盡量減短項目的早期研發時間,通??梢允褂闷脚_化的工藝進行放大生產。那么作為我們工藝人來說,除了放大研究及生產外,如何通過工藝開發,讓高表達細胞株的表達水平和產品質量能百尺竿頭更進一步,是一項不小的挑戰。

          工藝開發工作千緒萬端,每一個培養的細節都是開發需要考慮的因素,如培養基、補料、培養溫度、攪拌轉速、溶氧參數、pH參數等等,另外不同的培養方式,除傳統的補料流加培養,近年來興起的高密度接種、灌流培養等等,也是工藝開發的熱點??v觀這些因素,培養基及補料的開發和優化,在整個工藝開發過程中至關重要,無論是傳統的批次補料培養,還是灌流培養,培養基和補料對產品的產量和質量均有舉足輕重的影響,實際上灌流培養工藝開發的前期基礎是培養基的開發,否則從成本角度考慮幾乎體現不出灌流的優勢。本期皓奇星欄目將接力細胞株構建,從細胞生命規律的角度,一起學習培養基是如何發揮作用的。

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          圖1.CHO-GS克隆在不同培養基中培養的最終表達量

          (克隆及培養基來源:皓陽生物)

          1 培養基成分概述

          細胞吸收營養物質,合成自身組成物質,最后進行增殖需要一定的物質基礎,如水、無機鹽等無機物和蛋白質、核酸、脂質、糖類等有機物,這些物質基礎構成了細胞的結構基礎,如細胞膜,細胞質,細胞器,細胞核等等。只要培養的是具有生長和增殖能力的細胞,就必須提供基本濃度的這些物質基礎,而我們構建的CHO細胞作為生產工廠,顯然需要添加更多的營養成分去支持目的產物的合成。培養基的成分非常復雜,主要包含氨基酸、維生素、無機鹽、微量元素、碳水化合物、油脂、激素、生長因子等等。各類成分的作用及添加情況見下表。

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          2  能量代謝及能源物質

          細胞的一切生命活動都離不開能量,其生長增殖和蛋白表達需要消耗大量的能量,有研究表明每個細胞的平均干重大概在400pg,其中50%以上成分為蛋白質,而蛋白質合成主要是氨基酸通過肽鍵連接而成,每一個肽鍵的合成需要消耗3個ATP能量,而氧化一分子葡萄糖最終才產生約30個ATP能量,可見細胞就合成自身蛋白需要消耗多少能量,而一個高表達細胞株Qp能達到50pg以上,即每個細胞每天表達50pg蛋白,占到自身總蛋白近1/4。

          葡萄糖作為培養基中最主要的能源物質被細胞吸收利用。它首先通過質膜上的轉運蛋白進入細胞,在胞質內經多個步驟被分解為丙酮酸,這個過程稱為糖酵解,其中一部分丙酮酸進入線粒體被完全氧化為水和二氧化碳并產生能量的過程即為TCA循環,TCA循環是細胞產生能量的主要方式,在細胞快速生長階段,大部分丙酮酸(約90%)是在乳酸脫氫酶的作用下生成乳酸并分泌到胞外,所以這個階段會出現乳酸的積累,降低了葡萄糖的利用效率。除此之外,葡萄糖通過磷酸戊糖途徑可產生磷酸核糖,磷酸核糖是合成核苷酸的重要原料。

          谷氨酰胺是僅次于葡萄糖的第二大能源物質,谷氨酰胺除了用于合成細胞自身物質及目的蛋白外,大部分的谷氨酰胺被轉化成谷氨酸,谷氨酸進一步轉變成α酮戊二酸后進入TCA循環產生能量。需要注意的是GS系統的CHO細胞,由于轉入了外源性的谷氨酰胺合成酶基因,所以不需要從外界獲取谷氨酰胺,其表達的谷氨酰胺合成酶可將谷氨酸合成谷氨酰胺。

          3  氨基酸代謝及氨基酸類添加成分

          氨基酸是細胞合成蛋白的分子基礎,包括結構功能蛋白和目的蛋白。氨基酸分為必須氨基酸和非必須氨基酸,非必須氨基酸可由哺乳動物細胞合成,必須氨基酸細胞不能自身合成,必須由外環境提供,在培養基開發過程中,由于目的產物表達水平較高,細胞自身合成非必須氨基酸的速率一旦跟不上目的蛋白的合成速率,則容易發生錯配影響產物的表達,所以一般會添加所有約20種氨基酸。氨基酸濃度的優化是培養基開發中最重要的環節,其濃度的微小改變就能顯著影響細胞的生長和蛋白的表達。當然,在重組細胞中,大部分氨基酸用于合成蛋白質,還有一部分氨基酸被用于合成其它物質,如核酸和脂類物質。

          氨基酸的代謝由于有共同的結構特點,因此有很多共同之處,但不同的氨基酸由于結構上的差異,代謝有不同之處,主要代謝去向如下表統計。


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          從上表能看出,由于大部分的氨基酸通過脫氨基作用產生相應的α酮酸和氨根離子,因此氨根的積累是細胞培養中不可忽略的因素。此外,某些氨基酸通過轉氨基作用可以生成其它氨基酸,這些氨基酸既屬于非必須氨基酸。需要注意的是,由于酪氨酸和半胱氨酸的難溶性問題,一般以堿溶液的方式進行補料添加,現在市場上已有一些易于溶解的替代品,如默克開發的磷酸酪氨酸二鈉鹽和L半胱氨酸硫酸鈉鹽。


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          圖2.能量及氨基酸代謝通路

          (圖片來源:Sara Pereira, Helene Faustrup Kildegaard, and Mikael R?rdam Andersen Impact of CHO Metabolism> Production: An Overview of Toxic and Inhibiting Metabolites and Nutrients)

          4  維生素及其功能

          細胞的一切生命活動離不開生物催化劑酶,維生素作為酶的結合劑,與酶結合后催化細胞的生理活動,如代謝,能量轉移等等,培養細胞本身無法合成維生素,因此培養基中維生素是必須添加的一類物質,尤其是B族維生素,如硫胺素、核黃素、泛酸、吡哆醇、生物素、葉酸、氰鈷胺素、肌醇和維生素C等。細胞培養過程中常用的維生素功能如下表所示。

          有些培養基中會適量添加脂溶性維生素如生育酚,視黃醇或者添加維生素D的前體物質如膽固醇,盡管這些脂溶性維生素對細胞的生長有一定的影響,考慮其添加的復雜性及難溶性,一般不考慮優化這些成分。

          5  無機鹽及其對細胞的影響

          細胞質基質作為細胞質溶膠填充于有形結構之間,化學組成主要包括水、無機鹽,脂類、糖類、氨基酸、核苷酸、蛋白質等,為各種細胞器維持其正常結構和功能提供合適的離子環境及物質底物。所以合適的無機鹽濃度是細胞維持滲透壓及電位環境必須的。培養基中常見的無機鹽包括鈉、鉀、鎂、鈣、氯離子、磷酸鹽、硫酸鹽、碳酸氫根等。其中鈣離子在胞內信號轉導中發揮著重要的作用。磷酸鹽除了作為緩沖鹽之外,也是是核苷酸、核酸與磷脂的組成成分之一。鎂離子作為ATP的共軛離子,其在培養基中的添加濃度較高,通常是mM級別添加。需要注意的是有文獻報道合適的鈉鉀濃度比是細胞維持正常生理活動的基礎。

          6  微量元素及其主要作用

          微量元素也作為輔酶因子參與調節細胞的生理活動,在培養基開發的早期階段,由于培養基配制使用水的純度較低,其包含了一定程度的微量元素,現在由于配制水的純度大幅度提升,使得微量元素的開發顯得越發重要,培養基中常用的微量元素包括鋅、銅、鐵、錳、硒、鉬等。

          鐵是鐵硫蛋白、過氧化物酶及過氧化氫酶的重要組成部分,在氣體運輸、生物氧化和酶促反應中發揮重要的作用。一般鐵離子以絡合物的形式被細胞利用,游離的或無效的螯和鐵對細胞可能產生毒性,另外培養基中的超氧自由基或維生素C等還原劑可將三價鐵還原為二價鐵??紤]轉鐵蛋白的來源及成本問題,現在普遍用檸檬酸鐵氨作為鐵源加入到培養基中。

          鋅是含鋅金屬酶的組成成分,它與蛋白的折疊相關,能與蛋白質的二硫鍵有效結合,影響蛋白的穩定性和活性,在RNA/DNA合成、mRNA穩定及細胞抗凋亡過程中起到了不可或缺的作用,鋅離子同時還參與了谷胱甘肽和抗氧化酶如超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活化,可保護細胞免受ROS的攻擊。有文獻報道鋅離子濃度添加至25mg/L可以提高CHO蛋白的表達。需要注意的是,當在培養基受到氧化應激后,鋅離子可能與培養基中的氧化物、過氧化物和硫化物形成沉淀物而流失,培養基中其它成分如EDTA也可能會因為螯和作用降低鋅的利用率。

          銅離子在培養基中以一價還原銅和二價氧化銅的平衡存在,它可以氧化培養基中其它成分如半胱氨酸和維生素C,可與胱氨酸形成螯合物沉淀而導致致細胞培養基中半胱氨酸和胱氨酸的損失。培養基中半胱氨酸缺失后可停止蛋白和谷胱甘肽的合成。另外,某些細胞系中,培養過程中從乳酸生成向乳酸消耗的切換需要一定濃度的銅離子存在。

          7  脂質和脂質代謝

          脂質是細胞膜的主要組成之一,細胞膜保證了細胞內環境的相對穩定,同時調節和選擇相應物質進出細胞,是物質自由進出細胞的屏障,在物質運輸和蛋白分泌過程中也起了很重要的作用。細胞膜組成十分復雜,主要含甘油磷脂、鞘磷脂、糖脂、膽固醇、蛋白質和碳水化合物等,其中甘油磷脂中以磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸含量最高,其合成的基本原料為甘油、脂肪酸、磷酸鹽、膽堿、絲氨酸和肌醇等,而鞘磷脂的主要合成原料包括脂酰CoA和絲氨酸,此外還需要吡哆醛等輔酶的參與。所以培養基中需要添加膽堿、乙醇胺、肌醇等等這些原料成分。

          脂肪酸和甘油主要由葡萄糖代謝轉化而來,哺乳動物細胞因為不能合成9碳以上的不飽和鍵,在培養基中可以添加適量濃度的亞油酸和亞麻酸,或者花生四烯酸等,但考慮到這些物質的來源問題,及添加的復雜性,需謹慎開發。膽固醇作為細胞膜的基本結構成分之一,是決定細胞膜性質的一種重要成分,同時可以轉化為脂溶性維生素D3的前體。

          8  抗氧化物質

          所有細胞在培養過程中均會發生氧化應激,產生氧化中間產物,在無血清培養基體系中因缺乏抗氧化物質而更明顯,隨著活性氧濃度的增加會產生超氧自由基和過氧化氫,這些分子會損傷脂類、蛋白和DNA使細胞受到傷害。細胞存在兩類抗氧化系統,一類是酶抗氧化系統,包括超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶,另一類是非酶抗氧化體系,維生素C、維生素E、谷胱甘肽、硫辛酸、類胡蘿卜素、微量元素銅、鋅、硒等。在培養基設計的時候一方面需要使用抗氧化物質使細胞能有對抗氧化環境的能力,另一方面是減少培養基中不穩定成分被氧化的概率。

          谷胱甘肽作為培養基中常添加的抗氧化物質,由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成。在重組蛋白表達過程中,目的蛋白表達越多,細胞需要應對的氧化應激越顯著,產生越多的氧化型谷胱甘肽,有文獻報道氧化型谷胱甘肽的累積是細胞死亡的早期凋亡信號,是除了氨根和乳酸之外引起細胞凋亡的另一因素。


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          圖3.谷胱甘肽的合成及代謝

          (圖片來源:Sara Pereira, Helene Faustrup Kildegaard, and Mikael R?rdam Andersen Impact of CHO Metabolism> Production: An Overview of Toxic and Inhibiting Metabolites and Nutrients)

          9   核苷類物質

          細胞合成嘌呤和嘧啶核苷酸需要氨基酸作為原料,如嘌呤的合成需要甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺及一碳單位,嘧啶的合成需要天冬酰胺、谷氨酰胺及一碳單位,這是細胞合成核苷酸的其中一條途徑,即從頭合成途徑,另一條是補救途徑,即以現成的核苷和堿基為基礎合成核苷酸。DHFR能將二氫葉酸還原為四氫葉酸,而四氫葉酸是核苷酸從頭合成途徑的一個關鍵底物,DHFR缺陷型細胞因此無法從頭合成核苷酸,需在培養基中添加現成的核苷類物質如次黃嘌呤和胸苷才能存活。CHO-DHFR細胞的設計就是基于這個原理,通過外源性插入DHFR和目的基因,即可在無次黃嘌呤和胸苷的培養基中生長,同時添加DHFR抑制劑可增加DHFR和目的基因的拷貝數。一般核苷類物質占細胞干重的比例很低,不超過5%,且細胞自身能合成,所以培養基中的添加量很低或不添加。

          10  生長因子

          生長因子可促進細胞的生長和增殖,如胰島素,能調節細胞的代謝過程,促進細胞對葡萄糖的吸收和利用,同時能促進脂肪酸和蛋白質的合成,一般培養基中會添加,但是考慮培養基成本,現在普遍尋求能替代的化合物。

          11  其它成分

          細胞培養理化環境除了提供合適的滲透壓之外,還需要合適的粘度,培養基中常用的F68,是一類聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物,屬非離子表面活性劑,具有洗滌和消泡功能,其聚氧乙烯的比例越大,則親水性越強,細胞緩沖效果越好,洗滌活性也越強,而聚氧丙烯的比例越大則消泡能力越強,當然毒性也越大。培養基中添加1-2g/L濃度的泊洛沙姆在細胞抗剪切力方面有較好的效果,但缺點是容易形成泡沫。緩沖劑為培養基提供了穩定的pH范圍,常見的緩沖劑包括碳酸鹽,磷酸鹽緩沖體系以及HEPES。硫酸葡聚糖作為抗結團劑也是培養基中常見的一種添加劑。

          A high-throu細胞代謝錯綜復雜,涉及到的成分千千萬萬,如何使用有限的成分開發出優秀的培養基,是工藝人一直面臨的難題之一。需要我們首先從科學的角度出發,了解細胞的基本生命規律,熟悉基本生命物質的來龍去脈,再是借鑒前期的研究成果,培養基發展的前世今生經歷了多少代科學家的不懈努力,在此基礎上精益求精,才能走的更遠,最后需要借助現代化的分析檢測技術,分析物質的消耗和產出,從化學計量角度去實現細胞產能的最大化和最優化。


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